氮素是植物生长的必要大量元素，铵态氮（NH4+）和硝态氮（NO3–）是植物吸收氮素的主要形态。在许多自然和农业生态系统中，NH4+是主要的氮素形态。然而，随着工业化和城市化进程的快速发展，人工费贵和劳动力匮乏的问题也日益尖锐，为节省劳动力或者增加肥效，农业生产中经常采用一些“近根施肥”、“集中施肥”、“膜覆盖施肥”、“穴施”等增效措施和施肥方式；这些生产方式和农艺措施虽然符合农业实际生产需求，但也会造成短期内和施肥点的高NH4+浓度，形成NH4+毒胁迫环境，引发植物NH4+中毒。目前，NH4+毒胁迫已经成为现代农业生产和农林生态系统中不可忽视的问题。而不提高植物的NH4+耐性，则无法从本质上提高植物的NH4+利用率。因此，除进一步改进生产方式以外，从植物自身入手，探索调控植物NH4+耐性的重要基因，以增强植物自身对NH4+的耐受性，是一个可选择的重要途径。因此，很有必要了解高NH4+胁迫影响植物生长的内在机理。
我室施卫明研究员课题组围绕植物如何响应铵毒害的生理分子机制进行了长期且系统的研究。实验室之前研究发现NH4+主要通过影响拟南芥根系伸长区来抑制初生根生长，而这与NH4+外流的升高有关，但尚不清楚其潜在的生理和分子变化过程。此外，转录调控是植物应对NH4+毒性的最重要机制之一，但对于转录因子如何参与该调控的具体分子机制仍有待研究。
本研究利用NH4+处理和非处理的拟南芥根系为材料进行RNA-seq检测和分析，结果发现多个WRKY转录因子家族的转录水平受到明显诱导，其中，WRKY46对NH4+响应最灵敏。pWRKY46::GUS染色结果显示，高NH4+诱导根中，尤其是根尖部位WRKY46的上调。敲除及过表达株系表型分析表明，WRKY46主要在根伸长区部位发挥功能，并正调控高NH4+条件下的PR生长。
通过对不同遗传材料（野生型、WRKY46突变体及过表达材料）根分生区和伸长区的NH4+净通量进行检测，结果发现WRKY46负调控根伸长区NH4+的外流。已知GDP-甘露糖焦磷酸化酶（NUDX9）通过调节蛋白N-糖基化而参与调控高NH4+下的主根生长。本研究通过ChIP-qPCR、Y1H、EMSA及LUC活性检测发现，WRKY46直接与NUDX9启动子结合并负调控该基因的转录。随后对不同遗传材料根NH4+通量及糖基化水平的检测表明NUDX9作用于WRKY46下游并参与WRKY46依赖的高NH4+响应，但该过程还包含其他下游靶基因的参与。
已有研究显示，高NH4+下的主根生长抑制与生长素吲哚-3-乙酸（IAA）有关联，且WRKY46参与调控渗透/盐胁迫下根中IAA的含量（Diet al., 2021. Journal of Plant Physiology 261:153415; Ding et al., 2015. PlantJournal 84(1): 56-69）。通过pDR5::GUS检测发现，WRKY46表达差异所导致的NH4+敏感性差异与游离IAA含量有关。进一步实验结果显示，WRKY46直接与IAA结合基因（GH3.1、GH3.6、UGT75D1、UGT84B2）的启动子结合并抑制它们的转录，从而正调控游离IAA含量以抑制根伸长区NH4+外流。此外，进一步通过IAA及生长素合成抑制剂L-犬尿素外源处理检测发现，蛋白N-糖基化抑制的NH4+外流部分依赖于游离IAA含量。
综合所述，在高NH4+条件下，NH4+可诱导拟南芥中WRKY46转录因子的表达。随后，WRKY46直接与GH3.1、GH3.6、UGT75D1和UGT84B2基因启动子结合并抑制它们的表达，从而维持游离态IAA含量和初生根的生长。与此同时，WRKY46通过抑制NUDX9转录以稳定蛋白质N-糖基化水平，推测结合态IAA水解酶在N-糖基化后保持稳定，从而促进高NH4+条件下的结合态IAA的水解，维持游离IAA水平。总之，WRKY46通过抑制游离IAA到结合态IAA的转变和蛋白质N-糖基化来维持游离IAA稳态，是培育高NH4+耐受作物品种的宝贵遗传资源。
转录因子WRKY46 调控根部铵毒耐性的分子生理机制
该研究成果发表在New Phytologist（IF2021=10.151）上，狄东伟助理研究员和李光杰副研究员分别为论文第一作者和通讯作者。研究得到了国家自然基金重点基金项目、青年基金项目、江苏省杰出青年基金项目等资助。
